Esta es una traducción del artículo original “Autoclave Validation for Waste Decontamination in BSL-2, BSL-3, and BSL-4 Laboratories” publicado por el autor el 31 de enero de 2024.

La validación de autoclaves en laboratorios microbiológicos y biomédicos con niveles de bioseguridad 2, 3 y 4 es un requisito, pero no existen directrices ni normativas actuales sobre cómo validar y supervisar el proceso de descontaminación por vapor. Este artículo se centra en la descontaminación de residuos biopeligrosos líquidos y sólidos para su eliminación segura en el flujo de residuos municipales (pueden aplicarse las normativas locales). No se tratará la esterilización de medios de cultivo y equipos en términos de cumplimiento de criterios de calidad específicos (ISO 17025, ISO 15189), ya que no está contemplada en las normativas y directrices de bioseguridad ni en las buenas prácticas y procedimientos microbiológicos [1]. Sin embargo, la validación de estos procesos puede lograrse aplicando los mismos principios básicos que se presentan en este artículo.

Definiciones
Validación: Confirmación sistemática y documentada de que los requisitos especificados son adecuados para garantizar el resultado o los resultados previstos. Por ejemplo, para demostrar que un material está descontaminado, el personal del laboratorio debe validar la solidez del método de descontaminación mediante la medición de los agentes biológicos restantes con respecto al límite de detección mediante indicadores químicos, físicos o biológicos [1], [2]. 
Supervisión del proceso: la supervisión del proceso con indicadores biológicos del proceso de esterilización se utiliza para comprobar la idoneidad de un proceso de descontaminación [3].
Descontaminación: Reducción de agentes biológicos viables u otros materiales peligrosos en una superficie u objeto(s) a un nivel predefinido por medios químicos o físicos [1], [2].
Esterilización: Proceso que mata o elimina todos los agentes biológicos, incluidas las esporas [1], [2].

Introducción
Muchas industrias y laboratorios utilizan esterilizadores de vapor o autoclaves para eliminar la amenaza de microorganismos patógenos para la salud y la seguridad del personal, la comunidad, los pacientes, los consumidores o el medio ambiente. Los esterilizadores de vapor son el método preferido porque los procesos son fáciles de validar y controlar. Algunos ejemplos de aplicaciones son:
1.    La industria alimentaria utiliza autoclaves para esterilizar alimentos enlatados e ingredientes alimentarios.
2.    La industria farmacéutica esteriliza, por ejemplo, viales y envases de vidrio.
3.    Los hospitales y clínicas esterilizan artículos como ropa, material quirúrgico e implantes, y esterilizan en autoclave los residuos médicos antes de eliminarlos.
4.    Los laboratorios microbiológicos y biomédicos esterilizan los medios de cultivo, todo tipo de material de vidrio de laboratorio e instrumentos, que pueden estar regulados para un laboratorio específico por normas de calidad como ISO 17025 y 15189. También necesitan descontaminar los residuos de riesgo biológico antes de su eliminación.

En la mayoría de las industrias, la esterilización por vapor en autoclaves se considera el método de elección para garantizar la esterilidad o la descontaminación.

Los autoclaves se utilizan para procesos muy diferentes en cuanto a la naturaleza de la aplicación y, lo que es más importante, el objetivo de calidad. Las consecuencias de un proceso de esterilización o descontaminación fallido también son muy diferentes. Por ello, cada sector ha desarrollado sus propias normas para validar y controlar si el proceso de esterilización o descontaminación alcanza sus objetivos. En consecuencia, los métodos de validación y control del proceso varían en cierta medida según los sectores y las aplicaciones. Además, en algunas industrias es importante que el autoclave y el vapor estén muy limpios; las mercancías no deben contaminarse con impurezas del vapor o de las tuberías y cámara de vapor del autoclave.

Para la descontaminación de residuos en laboratorios microbiológicos y biomédicos, se pueden extraer lecciones de otras industrias, pero sus normas no deben adoptarse acríticamente (por ejemplo, de un estándar como ANSI/AAMI ST46:2002 [4])

Características de los residuos de laboratorios microbiológicos y biomédicos
Desgraciadamente, no existe ninguna norma ni orientación universal aceptada sobre la validación para la eliminación segura de residuos biopeligrosos procedentes de laboratorios microbiológicos y biomédicos. Hasta hace unos veinte años, no se exigía un método para validar un proceso de descontaminación de residuos. Lo que había se tomaba prestado de otras industrias. Y esto no siempre es apropiado para los laboratorios microbiológicos y biomédicos. Por ejemplo, en muchas industrias los artículos que hay que esterilizar ya tienen un bajo nivel de contaminación biológica. En cambio, los residuos de los laboratorios microbiológicos y biomédicos casi siempre tienen niveles muy altos de agentes biológicos por peso y volumen. Como el proceso de descontaminación es dinámico, estas diferencias pueden ser significativas.

Niveles de garantía de esterilidad (SAL)
El nivel de garantía de esterilidad (SAL) se utiliza en la mayoría de los procesos en los que debe garantizarse la esterilidad del producto [5]. El SAL indica la probabilidad de supervivencia de una sola célula tras un proceso de esterilización. Dado que la inactivación de los microorganismos sigue una función exponencial, 
se suele utilizar un SAL de 10^-6 para alcanzar una probabilidad suficiente de que todos los microorganismos hayan muerto. Un SAL de 10^-6 significa que la probabilidad de que sobreviva una sola célula es inferior a una entre un millón. Un SAL de 10^-6 se utiliza en procesos de esterilización en los que la contaminación supondría un riesgo importante, como los implantes médicos o los instrumentos quirúrgicos.

En el caso de los residuos de laboratorio, donde el número de bacterias y virus por carga suele ser muy elevado -puede llegar a 10^9 bacterias por ml o más-, el concepto SAL tiene sus límites. Sin embargo, la descontaminación segura de residuos biopeligrosos no es un problema, ya que la mayoría de los virus y bacterias vegetativas tienen un tiempo de supervivencia muy corto a 121°C, conocido como "tiempo de reducción decimal" o "valor D" [6].

La temperatura y el tiempo de exposición a las condiciones de vapor saturado son los parámetros necesarios que deben observarse. Es un error muy extendido creer que una temperatura de 121°C a una presión de 104,2 kPa durante 15 a 20 minutos es suficiente. De hecho, la resistencia térmica de los microorganismos viene definida por el valor D, el valor Z y el valor F [6].

El procedimiento de validación y la supervisión del proceso presentados en este artículo garantizan un nivel de seguridad adecuado. Para la validación se utiliza un organismo indicador biológico con una resistencia térmica muy elevada (Geobacillus stearothermophilus).

Tipos de cargas en laboratorios
En los laboratorios microbiológicos y biomédicos, la mayoría de las cargas de autoclave para la descontaminación de residuos entran en una de las cuatro categorías siguientes:
1.    Ropa usada de algodón o tejido plástico resistente al calor (productos secos sueltos o en bolsas).
2.    Residuos biopeligrosos de laboratorio como medios de cultivo sólidos (placas de Petri de agar, placas de agar, slants, etc.) en bolsas o contenedores y caldos de cultivo líquidos y medios de cultivo celular en frascos, tubos y botellas.
3.    Desechables, objetos punzantes y otros materiales (productos secos; en cajas, cubos punzantes o en bolsas).
4.    Cadáveres de animales (en bolsas o contenedores).

El proceso de autoclave requiere condiciones de vapor saturado para una descontaminación fiable y reproducible. Las condiciones de vapor saturado se consiguen al autoclavar residuos líquidos en botellas, tubos y viales.

Las mercancías en bolsas o cajas con prendas muy apretadas y otros materiales secos pueden ser problemáticas en este sentido, especialmente en autoclaves de desplazamiento o gravedad [6], donde el vapor, que tiene una densidad inferior a la del aire, debe desplazar el aire residual a través de la salida del autoclave por la parte inferior.

Por ejemplo, en las bolsas verticales, aunque el lazo esté flojo o la bolsa esté abierta, puede quedar aire atrapado en el fondo de la bolsa. Debe añadirse una taza de agua (aproximadamente 0,25 litros) a una bolsa de 30 litros para conseguir condiciones húmedas. El agua puede añadirse con seguridad a las bolsas de residuos en un laboratorio BSL-2. Para los residuos generados en un entorno de mayor riesgo, como BSL-3, la adición de agua puede asociarse a la formación de aerosoles. Una opción es añadir el agua a la bolsa antes de añadir los residuos. Otra opción es colocar los residuos en una bolsa que se derrita en el autoclave. A continuación, esta bolsa (atada) se introduce en una bolsa de autoclave normal abierta que no se derrita. De este modo, los residuos permanecen sellados hasta que el vapor derrite la bolsa interior. Se añade agua a la bolsa exterior.

En las autoclaves de ciclo de vacío no es necesario añadir agua, pero es importante que el vapor y el aire puedan entrar y salir de la bolsa. La bolsa puede colocarse en el autoclave en posición vertical, pero la atadura debe permitir que el aire y el vapor entren y salgan de la bolsa. Los ciclos de vacío eliminarán entre el uno y el cinco por ciento del aire, lo que es suficiente para descontaminar los residuos. Cuando se utilizan bolsas bien atadas y contenedores herméticos en autoclaves de ciclo de vacío, pueden reventar o implosionar durante el ciclo de vacío/vapor

Prueba Bowie-Dick
En los hospitales y otros centros sanitarios en los que el proceso de autoclave asistido por vacío debe cumplir estrictos requisitos de calidad y esterilidad, se utiliza la prueba de Bowie-Dick para comprobar que no hay aire residual en el centro de una carga de instrumentos estériles envueltos [4], [6].

La prueba Bowie-Dick no es obligatoria en los laboratorios microbiológicos y biomédicos. El método de validación que aquí se presenta es suficiente para garantizar que se cumplen los requisitos de descontaminación.

Prueba de aceptación en planta del autoclave (SAT, OQ)
La cualificación de un autoclave consiste en una prueba y calibración de la cámara realizada por el técnico o ingeniero del fabricante tras la entrega e instalación.
Esto se conoce como prueba de aceptación en planta (SAT) o cualificación operativa (OQ).

Se utiliza un juego de termopares calibrados y certificados para probar y comprobar que se alcanza el perfil tiempo-temperatura en toda la cámara y para recalibrar los termopares internos del autoclave si es necesario. La prueba de la cámara y la calibración deben repetirse después de cada servicio, pero al menos 
una vez al año. No hay carga presente a menos que los usuarios hayan incluido en el contrato la validación del proceso de cargas estándar.

El SAT u OQ confirma el correcto funcionamiento básico del autoclave antes de su entrega al usuario final.
La validación posterior de la carga (denominada validación del proceso, PQ) suele correr a cargo del usuario final.

Indicadores biológicos y termopares
Un indicador biológico (BI) es un dispositivo de control del proceso de esterilización o descontaminación, consistente en una población normalizada y viable de microorganismos (normalmente esporas bacterianas, Geobacillus stearothermophilus). Los indicadores biológicos se utilizan para comprobar la conformidad del proceso con los requisitos de descontaminación [3], [4], [6]. Deben seguirse las instrucciones del fabricante para su correcta utilización. Los indicadores biológicos de lectura rápida permiten controlar la eficacia del proceso de descontaminación en una hora. Esto es útil en situaciones en las que cada carga debe ser limpiada antes de su eliminación final, o cuando se requiere un resultado con urgencia.

Los indicadores químicos (como cintas o pastillas indicadoras) se utilizan para distinguir entre artículos procesados y no procesados (indicadores externos). Advertencia: los indicadores químicos no pueden utilizarse para determinar si el proceso se ajusta a los requisitos de descontaminación. Los indicadores químicos pueden ayudar a identificar rápidamente un mal funcionamiento grave de un autoclave. Si los indicadores químicos no responden, el proceso ha fallado.
Los termopares o los registradores de temperatura son útiles para determinar si se alcanza la temperatura establecida en el interior de bolsas, cajas, contenedores o bidones. Si la prueba BI falla, el registro de la temperatura puede ayudar a determinar el motivo del fallo. En la mayoría de los casos, una prueba BI fallida se debe al aislamiento en bolsas o contenedores grandes, al uso de bolsas de residuos que no son permeables al vapor y/o a la falta de desplazamiento del aire en autoclaves asistidos por gravedad. Para fines de descontaminación, el registro de temperatura realizado adecuadamente puede ser un medio apropiado y suficiente para supervisar un proceso.

En lugar de termopares y registradores especiales, es muy útil el uso de termopares internos suministrados con el autoclave (incluidos en algunos modelos para evitar el sobrecalentamiento de los productos líquidos). Si no se dispone de ellos, basta con la validación del indicador biológico. El éxito de la validación del indicador biológico (BI) es un criterio suficiente (el BI se considera la prueba de fuego).

Validación de la carga (PQ)
El objetivo de la validación de la carga es determinar y validar los programas y tipos de carga que el usuario final utilizará para descontaminar los residuos. El usuario final (la dirección del laboratorio, el responsable de bioseguridad, etc.) debe ser capaz de llevar a cabo esta validación de la carga por sí mismo. Forma parte de la tarea de establecer y adoptar el sistema de gestión de biorriesgos, en particular los PNT para el tratamiento de residuos y el funcionamiento del autoclave.

Normalmente, habrá que validar entre dos y cuatro tipos de carga. Al menos una carga seca y una líquida deberán ser validadas. En el caso de laboratorios microbiológicos y biomédicos grandes y complejos, en particular instalaciones de bioseguridad animal, puede haber cargas de bolsas de jaulas y ropa de cama, bolsas o incluso bidones de heces, residuos de necropsias, etc.). En este caso, la validación y la supervisión del proceso pueden llevar mucho tiempo y ser costosas.

La validación de la carga se lleva a cabo utilizando las denominadas cargas estándar, que se caracterizan por el número, tamaño y masa máximos de los artículos que deben esterilizarse en autoclave en un único proceso. La carga estándar describe la carga máxima admisible para un proceso concreto en el que debe garantizarse una descontaminación segura. En otras palabras, se basa en un escenario realista del "peor caso". Para operaciones rutinarias, se pueden utilizar menos cargas o cargas más pequeñas del mismo tipo, pero no cargas más grandes o comprimidas.

En particular, si las prendas y otros productos comprimibles se esterilizan en autoclave en bolsas o cajas, el número de artículos y el grado de compresión son relevantes. Por ejemplo, debe limitarse el número de prendas por bolsa. En el caso de los líquidos, el volumen, el material y el grosor de las paredes y la forma de los recipientes son relevantes. En el caso de los cadáveres, hay que anotar el número, el tamaño (masa) y la disposición geométrica (apilados o uno al lado del otro) en bolsas o cajas de cartón. Fotografiar las cargas estándar es útil para especificar la carga estándar en un PNT y con fines de formación.

La validación de la carga se realiza del siguiente modo:
1.    Identifique el tipo de cargas que tendrá para la descontaminación rutinaria (bolsas, contenedores, botellas, etc.).
2.    Describa la carga en términos de número máximo de ítems, composición, mayor tamaño de bolsa o contenedor, cuántos de ellos serán colocados en la bandeja de la autoclave y dónde exactamente (geometría de la carga). En el caso de las bolsas, describa cuánto hay que aflojar las ataduras. Tome fotografías y tome notas.
3.    Validar la carga utilizando tiras indicadoras biológicas (sólidos) o ampollas (líquidos) y, si se dispone de ellos, termopares o registradores de temperatura (sensores).
4.    Deben colocarse de dos a tres tiras de BI y sensores en el centro y/o hacia el tercio inferior de las bolsas y contenedores. Para mercancías concretas, debe determinarse experimentalmente la ubicación adecuada 
1.    de las BI y los sensores a efectos de validación.
5.    Para la validación de la descontaminación de canales, las ampollas y los sensores se colocarán en el centro de las canales. La validación de la descontaminación de canales por vapor requiere especial cuidado y experiencia, ya que las canales pueden variar considerablemente de forma y tamaño. Deberá utilizarse el mayor tamaño posible de canal. Si se van a descontaminar tubos o mangueras largos, deben cortarse por la mitad. La tira y el sensor se insertan a cierta distancia del corte y los dos extremos del tubo o manguera se vuelven a unir y sellar para el proceso.
6.    Una carga y un proceso se consideran validados para la descontaminación después de tres ciclos satisfactorios (todos los BI son negativos, el perfil de temperatura cumple los requisitos).
7.    Para cada serie, debe utilizarse una tira o ampolla de BI como control (control positivo de crecimiento).
8.    La validación de la carga se repite al menos una vez al mes, siempre que cambie la carga o después de una reparación del autoclave o sospecha de mal funcionamiento.

Supervisión de procesos
La autoclave ya está lista para su uso rutinario. Cada proceso individual debe ser monitorizado utilizando al menos los parámetros físicos del autoclave (temperatura, tiempo, presión) e indicadores químicos.

Los indicadores biológicos deben utilizarse al menos mensualmente para verificar la idoneidad de la descontaminación. Para los laboratorios de mayor riesgo, como los de BSL-2 mejorado, BSL-3 o BSL-4, o si por alguna razón los lotes muestran mucha variación, puede requerirse la monitorización de BI con más frecuencia o incluso en cada lote. Los métodos y la frecuencia de la supervisión de BI deben evaluarse mediante una evaluación de riesgos microbiológicos. Si el control falla, debe investigarse la causa y resolverse el problema antes de reanudar las operaciones rutinarias. Los lotes afectados deben ponerse en etapas y volver a esterilizarse en autoclave hasta la revalidación satisfactoria del autoclave.

Todos los registros deben conservarse adecuadamente de acuerdo con el sistema de gestión de riesgos y la normativa local.

Referencias
[1] OMS (2020). Manual de bioseguridad en el laboratorio, cuarta edición. Ginebra: Organización Mundial de la Salud; (Laboratory biosafety manual, fourth edition and associated monographs). Internet: https://www.who.int/publications/i/item/9789240011311. Consultado en enero de 2024.
[2] ISO 35001 (2019). " Biorisk management for laboratories and other related organisations". Internet: https://www.iso.org/standard/71293.html. Consultado en enero de 2024.
[3] US FDA, Title 21, Volume 8. 21CFR880.2800. Internet: https://www.ecfr.gov/current/title-21/chapter-I/subchapter-H/part-880. Consultado en enero de 2024.
[4] ANSI/AAMI ST46-2002. Steam Sterilization and Sterility Assurance in Healthcare Facilities. Internet: 
https://webstore.ansi.org/standards/aami/ansiaamist462002. Consultado en enero de 2024.
[5] Wikipedia. Nivel de garantía de esterilidad. Internet: https://en.wikipedia.org/wiki/Sterility_assurance_level. Consultado en enero de 2024.
[6] McDonell (2017). ). Antisepsis, Disinfection, and Sterilization: Types, Action, and Resistance, 2nd Edition. Internet: https://www.wiley.com/en-gb/Antisepsis,+Disinfection,+and+Sterilization:+Types,+Action,+and+Resistance,+2nd+Edition-p-9781555819675. Consultado en enero de 2024.